rt-qpcr 是一种用于实时扩增和检测特定 dna 或 rna 序列的分子生物学技术。该方法利用荧光染料或探针，当与扩增的 dna 或 rna 分子结合时会发出信号，从而可以对目标序列进行量化。rt-qpcr 通常用于基因表达分析、病毒载量定量和基因突变检测等应用。
rt-qpcr原理的三个主要步骤：
1 反转录：
· 使用逆转录酶和特定引物将rna样品反转录成cdna。
· 该步骤将rna模板转化为更稳定且可扩增的dna形式。
· 反转录过程中使用特定引物。
2 pcr扩增：
· 使用特定引物对cdna进行pcr扩增，这些引物环绕目标区域。
· pcr是一个循环过程，呈指数级扩增dna模板的数量。
· pcr反应中包含荧光染料或探针，它们结合到扩增的dna序列上并发出荧光信号。
3 荧光实时检测：
· 使用实时pcr仪器实时监测荧光信号。
· 荧光的数量与每个pcr循环中扩增的dna数量成比例。
· 使用专业软件分析数据以确定循环阈值（ct）值，该值表示荧光信号达到特定阈值水平所需的循环数。ct值用于计算原始样品中存在的目标dna量，从而允许进行基因表达或病毒载量等定量分析。
实验步骤：
一、rna提取：
rna的提取是参照全式金生物的transzol up提取试剂盒完成的。
1、离心机4℃预冷，准备试剂：氯仿、异内醇、75%乙醇（用depc水配制）、无rnase的水或depc水、无酶吸头及试管，戴口罩、帽子、无粉乳胶手套；
2、取出转染建模成功24h后的细胞，吸弃培养液，用1×pbs清洗1次；
3、每10cm2生长的细胞加入1ml的transzol up, 放置片刻后使用移液枪吹打细胞使其全脱落；
4、用移液枪反复吹吸裂解液直至无明显沉淀，将裂解液全部转移至标记好的1.5ml ep管中，室温静置5min；
5、往每个ep管中加0.2ml氯仿（transzol up体积的1/5），混匀振荡30s，室温静置3min；
6、4℃条件下10000g离心15min，离心后rna主要分布在上层水相中，体积约50%；
7、转移上层水相于新的ep管中（约400μl，注意不要吸取到下层），每管加入0.5ml异丙醇 （transzol up体积的1/2），颠倒混匀，室温孵育10min；
8、4℃下10000g离心10min后在管侧和管底形成胶状沉淀，吸弃上清，加1ml 75%乙醇吹悬沉淀；
9、4℃下7500g离心5min后弃上清，尽量吸净，室温晾干沉淀5min，依细胞量加入30~100μl的rna溶解液；
10、55℃~60℃金属浴10min，-80℃冰箱保存备用。
二、cdna合成
三、qpcr：
在abi荧光定量pcr仪专用96孔板中建立qpcr反应体系，反应程序为两步法。
4、rt-qpcr统计：每个基因在不同组别中的表达在获得3个重复的ct值后，从abi系统中拷贝原始数据，挑出“ct sd”值大于0.5的组别（需重新实验），求出各个组的管家基因gapdh的均值（一般相差1个ct值以内），再依次求出实验组和对照组与各自的gapdh之间的ct差值，即得到第一个δct，随后求出实验组δct和对照组δct的差值，即可得到第二个δct（δδct），最后使用2 -δδct法求出实验组相对于对照组的ct值变化倍数（实验组2 -δδct/对照组2 -δδct=实验组2 -δδct/2 0=实验组2 -δδct）。将3组实验组数据导入graphpad 9.0，输入对照组数据为1，使用student's t或anova进行假设检验，p<0.05被认为有统计学差异。
