聚合酶链反应(pcr)技术是在体外进行的由引物介导的酶促dna扩增反应。pcr的原理是在模板dna、pcr引物、四种脱氧核糖核苷酸(dntp)及适当浓度的mg2 存在的条件下，依赖于dna聚合酶的体外酶促合成反应。两个引物分别位于靶序列两端，同两条模板的3’端互补，由此限定扩增片段。pcr反应由一系列的变性→退火→延伸反复循环构成，即在高温下模板双链dna变性解链，然后在较低温度下同过量引物退火，再在适中温度下由dna聚合酶催化进行延伸。理论上，经过n次循环可使特定片段扩增到2n-1，考虑到扩增效率达不到100%，所以通常经25到30次循环可扩增到106倍，足够后续实验展开。
常见问题分析与解决方法：
1、无扩增条带
1)酶失活或在反应体系中未加入酶。taq dna聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。
2)模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成dna脱嘌呤而影响pcr的结果。
3)变性温度是否准确：pcr仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不全。
4)反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加taq酶以前，将反应体系95℃加热5-10 min。
5)引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。
6)引物错误。利用blast检查引物特异性或重新设计引物。
7)dna凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是dna凝胶和pcr程序的问题。
2、pcr产物量过少
1)退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度pcr反应优化退火温度。
2)dna模板量太少。增加dna模板量。
3)pcr循环数不足。增加反应循环数。
4)引物量不足。增加体系中引物含量。
5)延伸时间太短。以1 kb/min的原则设置延伸时间。
6)变性时间过长。变性时间过长会导致dna聚合酶失活。dna模板中存在抑制剂。确保dna模板干净。
3、扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散
1)酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。
2)dntp浓度过高。减少dntp的浓度。
3)mgcl2浓度过高。可适当降低其用量。
4)模板量过多。质粒dna的用量应<50 ng，而基因组dna则应<200 ng。
5)引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复pcr反应。
6)循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的pcr循环。
7)退火温度过低。
8)电泳体系有问题：
①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；
②凝胶没有凝固好；
③琼脂糖质量差。
9）若为pcr试剂盒则可能：
① 由于运输储存不当引起试剂盒失效；
② 试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。
10）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。
4、扩增产物出现多条带(杂带)
1)引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。
2)循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。
3)酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。
4)退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的pcr扩增。以2度为梯度设计梯度pcr反应优化退火温度。
5)样品处理不当。
6)mg2 浓度偏高，因适当调整mg2 使用浓度。
7)若为pcr试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。
8)复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
9)反应缓冲液未全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化全并混匀。
10)引物特异性差。利用blast检查引物特异性或重新设计引物。
11)引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
12)模板量过多。质粒dna的用量应<50ng，而基因组dna则应<200ng。
13)外源dna污染。确保操作的洁净。
5、阴性对照出现条带
试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
6、条带大小与理论不符
1)污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
2)模板或引物使用错误。更换引物和模板。
3)基因亚型。对研究的基因进行序列分析和blast研究。
